HISTORIA DE CULTIVO DE TEJIDO

El cultivo de tejidos ha sido considerado durante mucho tiempo como una mezcla de ciencia y arte. Fue considerada inicialmente como una técnica particularmente difícil de aprender. Sin embargo, estas dificultades de los comienzos están hoy en día prácticamente superadas gracias a factores como la disponibilidad de antibióticos, los medios de composición definida, las instalaciones asépticas (salas de cultivo limpias, cabinas de flujo laminar, incubadores estériles), dispositivos de cultivo (botellas con tapones filtrantes, placas de Petri ventiladas).

Los avances técnicos y la aparición de un buen número de compañías comerciales de suministro de medios, sueros, equipo y líneas celulares han hecho del cultivo celular una tecnología con buena reproducibilidad (Reina, 2003).

El cultivo de tejidos, como técnica, consiste esencialmente en aislar una porción de la planta (explante) y proporcionarle artificialmente las condiciones físicas y químicas apropiadas para que las células expresen su potencial intrínseco o inducido. Es necesario además adoptar procedimientos de asepsia para mantener los cultivos libres de contaminación microbiana (Roca & Mroginski _____).

A diferencia de las técnicas tradicionales de cultivo, esta poderosa herramienta permite la propagación de grandes volúmenes de plantas en menor tiempo; así como el manejo de las mismas en espacios reducidos. Por otro lado, la técnica es de gran utilidad en la obtención de plantas libres de patógenos; plantas homocigotas, en la producción de plantas en peligro de extinción, en estudios de ingeniería genética, etc. (Aceves & Hernández _____).

El enorme potencial que posee esta metodología ha propiciado que en los últimos 25 años se haya incrementado el número de laboratorios de cultivo de tejidos, para la producción comercial de plantas ornamentales y frutales a lo que ha motivado que algunos floricultores la estén utilizando como una alternativa viable en sus programas de producción (Aceves & Hernández __).

Esta técnica es conocida como cultivo in vitro, cultivo aséptico y micropropagación o cultivo de meristemas, sin embargo estos dos últimos términos pueden dar lugar a confusiones (Montoya, 1991).

El fundamento teórico del cultivo in vitro es el concepto de la totipotencialidad celular.

La totipotencia es la capacidad que tiene una célula somática de regenerar un planta completa e igual a la planta madre.
La célula y el núcleo contiene los planos (genes) que van a hacer que las plantas se regeneren.

Schleiden y Schwan (1887) describen en su teoría celular, que la célula es capaz de subsistir por si sola si las condiciones externas le son favorables.

A Morgan (1901) se le atribuye el término de la totipotencialidad celular propiamente dicho, que dice que una célula es capaz de desarrollarse hasta formar un organismo completo si las condiciones ambientales le son favorables y si se le aplican los estímulos adecuados.

La totipotencialidad celular había sido anunciada por Haberlandt en 1902, quien propuso la teoría de que todas las células vegetales tienen la capacidad de regenerar plantas completas. Este autor, sin embargo, no pudo demostrar su hipótesis debido a que no pudo lograr la división celular porque los medios de cultivo que empleaba no incluían reguladores del crecimiento, aún desconocidos en ese entonces. Los avances en cultivo de tejidos fueron muy lentos en sus inicios. (Radice, ___).

Asimismo, fue el primero en emplear el concepto de callo para definir una masa amorfa de células (Villalobos, 1990, citado por Sánchez___).
Él trabajó con células de empalizada, estambres y células guardas de los estomas.

1655, Hooke describe la estructura celular. Fue el primero de observar las células de corcho.

1674, Leeuwenhoek observación de la vida celular

1835, Von Monl describió la división celular

1838, Schleiden y Schwan fueron los primeros en postular que cada célula viva de un organismo multicelular podría estar en capacidad de desarrollarse, si se le proporcionan las condiciones apropiadas, o dicho en otras palabras, que las células individuales de un organismo son totipotentes (Montoya, 1991).

1846, Nageli observo la formación de las células mediante la división sucesiva.

1855, Virchow aforismo: onnis cellua e cellula (toda célula proviene de otra).

1860, Sachs y Knops plantean que los principales nutrientes de plantas eran inorgánicos y la consiguiente preparación de soluciones nutritivas se considera un gran aporte a las técnicas de cultivo in vitro.

1922, kotte fue el primero en hacer cultivo de ápices de raices.

1926, Went descubrió las auxinas

1922, Robbins realizó cultivo de raíces.

1928, Kuster trabajó con protoplastos obtenidos mecánicamente

El primero en cultivar tejidos vegetales con éxito fue White en 1934, quien logró cultivar ápices de raíces de tomate en medios enriquecidos con sales, azúcares y levadura. Demostró además, la sustitución de levadura por tres vitaminas del grupo B: Tiamina, Piridoxina y Niacina.

No es sino hasta 1934 cuando Gautheret logra proliferación celular in vitro en tejidos cambiales provenientes de plantas adultas. En 1939 el mismo Gautheret, Nobecourt (en tejidos de zanahoria) y White (en tejidos de tabaco) publican casi simultáneamente la formación de una masa de células parenquimatosas (callo) a partir de los explantes (tejidos) utilizados en sus experimentos. Este hecho significativo constituye en sí el despegue de las técnicas de cultivo in vitro.

En 1939, trabajando en laboratorios diferentes, Nobecourt y Gautheret en Francia y White en Estados Unidos, crecieron teji­dos de raíz y observaron formación de callos en medio semisólido.

Un factor importante en el desarrollo de las técnicas de cultivo de tejidos vegetales, fue el descubrimiento de los reguladores de crecimiento. Overbeek (1941) observa el efecto de una sustancia presente en el agua de coco que estimulaba la división celular (efecto citocinínico). Cuando el agua de coco se combinaba con 2,4-D, tenía un efecto positivo en el desarrollo de tejidos de zanahoria y papa (Caplin y Steward 1948, 1952).

Skoog y colaboradores observaron que el esperma de arenque, desnaturalizado por calor, tenía un efecto muy marcado en la formación de brotes a partir de tejidos de tabaco. De este ácido desoxirribonucleico (ADN) desnaturalizado Miller y colaboradores (1955) aislaron un compuesto de naturaleza purínica denominado 6- furfuril-aminopurina o cinetina.

1952, Steward utilizo agua de coco como medio enriqueedor (endostermo líquido).

1953, Muir realizó cultivo de suspensiones celulares y el aislamiento de células individuales.

1953, Tulecke utilizó anteras para cultivar polen.

Un hecho importante que permitió el desarrollo del cultivo de tejidos, fue la identificación de la kinetina, lo cual permitió a Skoog y Miller en 1957 postular la hipótesis de que la iniciación de raíces y brotes en cultivos de callos, puede estar regulada por la relación auxina-citoquinina en el medio de cultivo.

1964 Nitsch introdujo la utilización en cultivo in vitro.

1964, Guha y Maheshwary obtuvo plantas haploides a partir de antera.

Las primeras plantas libres, de virus fueron obtenidas por Morel y Martin, usando como explante el meristema.

En 1926 dos científicos japoneses descubrieron un compuesto hormonal, actualmente de uso ordinario en el cultivo in vitro de tejidos vegetales denominado giberelina el cual es producido por un hongo Gibberella fujikoroi; este compuesto fue descubierto cuando ellos estudiaban la causa de la pudrición en plántulas de arroz. El efecto que producía dicha sustancia era un alargamiento excesivo en los tallos, sin desarrollo proporcional de la raíz. Actualmente se le atribuyen otros efectos como la inducción de germinación en semillas, brotación en algunos tubérculos como la papa etc.

Von Sachs
Fundador de la fisiología vegetal y descubrió el papel de la clorofila en la fotosíntesis y en que lugar se daba, también planteó que las células hijas salían del mismo tamaño que la de la madre.

Tipos de cultivos de tejidos.

Se podría hablar de tres tipos de cultivos:

a. Cultivo de órganos. Implica que la arquitectura característica del tejido 'in vivo' se mantiene al menos en parte. Para ello el órgano se mantiene en un medio del que obtiene los nutrientes y al que puede liberar los desechos y en el que mantiene su estructura tridimensional, en general esférica. Este tipo de cultivo permite mantener los tipos celulares diferenciados y es por ello una buena réplica del tejido de origen, pero por el contrario no permite su propagación pues el crecimiento, de producirse, se limita a la periferia y es debido fundamentalmente a los tipos celulares embrionarios. La imposibilidad de propagar obliga a partir en cada nuevo experimento de nuevo material animal lo que conlleva una elevada hetereogeneidad (Reina, 2003).

b. Explantes primarios. Fragmentos de tejidos o de órganos que se adhieren a una superficie y en la que proliferan las células de la periferia del explante.

c. Cultivo celular. Supone una disgregación celular ya sea por medios enzimáticos o mecánicos. La suspensión celular se puede cultivar como una monocapa adherente o en suspensión en el medio de cultivo. Este tipo de cultivo permite su propagación, aumentando notablemente la masa celular del cultivo a lo largo de las generaciones. Como característica negativa se pierde la hetereogeneidad celular de partida, la población se hace uniforme y homogénea al predominar en el cultivo aquellos tipos celulares que tienen superior tasa de crecimiento (Reina, 2003).

En la actualidad los cultivos celulares son los más empleados fundamentalmente por la posibilidad de propagación, así como por las ventajas en la cuantificación, caracterización y repetibilidad de las muestras. A fin de compensar la ausencia de interacciones heterotípicas se realizan desde hace unos años cultivos mixtos con importantes éxitos (Reina, 2003).

Aplicaciones
Cultivo de meristemas, ápices y yemas.
Micropropagación masiva.
Estudios teóricos sobre fisiología y bioquímica vegetal.
Rescate de cultivo de microesporas y anteras.
Hibridación somática.
Mejoramiento genético mediante la inducción de mutaciones y la selección in vivo.
Erradicación de plagas.
Producciones de metabolitos primarios (carbohidratos, proteínas y lípidos).
Producción de metabolitos secundarios (alcaloides, resina) como mecanismo de protección.
Ingeniería genética para incorporar genes para resistencia.

Plantas que se pueden obtener por cultivo in vitro

Plantas ornamentales: Entre las que más se han trabajado se encuentran muchas especies de orquídeas, lirios y rosas.
Frutales: Como la piña, mango y aguacate.
Plantas agrícolas: Como la banana y la patata.
Cultivos agroindustriales: Como la caña de azúcar y la palma de aceite.
Árboles maderables: Como la varía, cedro y teca.
Variedades energéticas: Especies de plantas con gran contenido de fibra, como la caña de azúcar, que puedan ser utilizadas como combustible en las grandes industrias (Santana ___).
Ventajas que ofrece el cultivo in vitro
- Es uno de los métodos conocidos más utilizado actualmente para erradicar patógenos.
- Propagación clonal masiva de plantas libres de enfermedades en corto tiempo.
- Reduce los costos de labores agronómicas en el mantenimiento de germoplasma en campo.
- Los materiales pueden ser propagados en cualquier época del año.
- Facilita el intercambio de material genético.
- Reduce el riesgo de pérdidas genéticas al evitar la mezcla del material por cruzamiento.

Desventajas del cultivo in vitro

-Requiere de personal especializado.
-Requiere de, infraestructura y equipamiento.
-Los productos químicos son de elevado costo.

TIPOS DE CULTIVOS IN VITRO

El siguiente esquema resume los principales tipos de cultivo in vitro.


Figura 1. Tipos de cultivos in vitro. (modificado a partir de Lindsey y Jones, 1989, en Plant biotechnology in agriculture. Open University Press, Wiley, Chichester, p 59)
(file:///C:/Documents%20and%20Settings/Usuario.xp/Mis%20documentos/cultivo%20de%20tejido/tipus.htm).

BIBLIOGRAFIA


Aceves, R, J, L. & Hernández, H, J.___ Propagación comercial de plantas ornamentales por cultivo in vitro de tejidos vegetales para beneficio social de la comunidad. http://www.uv.mx/iiesca/revista2/aceves2.html

Montoya, H, L, M. 1991. Cultivo de tejido vegetal.

Radice, S.____ PARTE II Herramientas Básicas. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal. http://www.inta.gov.ar/ediciones/2004/biotec/parte2_cap1.pdf

Reina, M. 2003. Técnicas de estudio de líneas celulares. Capítulo 1: Introducción al cultivo celular. http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/cap1.htm

Roca, W, M & Mroginski, L, A.____establecimiento de un laboratorio para cultivo de tejidos vegetales. Capitulo Nº 1.

Sánchez, M, I. R.___ Aplicaciones del cultivo de tejidos vegetales en las ciencias biológicas. http://redexperimental.gob.mx/descargar.php?id=222

Santana, O._______ Cultivo In Vitro. Revista digital de jardinería http://www.jardinactual.com/articuloshtm2.php?articulo=278


Tipos de cultivos in vitro
file:///C:/Documents%20and%20Settings/Usuario..xp/Mis%20documentos/cultivo%20de%20tejido/tipus.htm



TALLER DE MERISTEMAS Y YEMAS

1. ¿Qué son tejidos meristemáticos?
Son tejidos embrionarios capaces de diferenciarse o perpetuarse; es decir, se multiplican activamente para formar los tejidos adultos diferenciados (crecimiento y especialización) y a su vez originan nuevas células meristemáticas. También producen crecimiento en las plantas en sentido longitudinal y diametral.

2. ¿A que tipo de crecimiento dan origen los tejidos meristemáticos?
Los meristemas permiten que se produzca el crecimiento de las plantas en sentido longitudinal y diametral. El crecimiento longitudinal, también es llamado crecimiento primario, y se produce por la acción del meristema apical; mientras que el crecimiento diametral o en grosor, también denominado crecimiento secundario, se produce por divisiones que ocurren en el cambium vascular y, en menor proporción, en el cambium cortical.

3. ¿Cuáles son las principales características de las células meristemáticas?
Son células indiferenciadas, pequeñas e isodiamétricas (excepto cambium vascular), forman tejidos compactos, sin espacios intercelulares, gran núcleo (difuso) y poco citoplasma, pared celular delgada constituida de pared primaria y lamela media. No poseen inclusiones citoplásmicas y con pocos orgánulos: abundantes ribosomas libres y retículo endoplasmático (liso y rugoso) escaso, mitocondrias escasas y con pocas crestas, presentan protoplastidios.

4. ¿En cuáles regiones del vegetal se encuentran localizados los meristemas?
Se encuentran localizados en lugares específicos de la planta:
· Apicales: localizados en el ápice de los órganos (tallo, raíces, glándulas, etc.)
· Básales: localizados en la base de los órganos (espinas).
· Intercalares: situada en las células diferenciadas (maduras) contribuyendo el crecimiento de ambos lados.
· Laterales: localizados en la periferia de los órganos, favoreciendo el crecimiento en grosor.
· Axilares: son los meristemos apicales de las yemas, situados en las axilas de las hojas.

5. ¿Cómo se clasifican los tejidos meristemáticos?
Según la posición topográfica en la planta, se clasifican en:

Según la posición topográfica en la planta: apicales, básales, intercalares, axilares y laterales.
Según la naturaleza de la célula que lo forma: primarias- provienen de células que no han perdido división. Secundarias –provienen de células diferenciadas que nuevamente se dividen.
Según el tiempo de aparición: primarios—son capaz de producir tejidos primarios. Secundarios—se originan a partir de tejidos primarios, por desdiferenciación produce tejidos secundarios.

6. ¿Cómo se clasifican los meristemas primarios? Descríbalos.
Protodermis: Meristema primario que da origen a la epidermis.
Meristemas fundamentales o básicos El meristema podría definirse como la región donde ocurre la mitosis, un tipo de división celular por la cual de una célula inicial se forman dos células hijas, con las mismas características y número cromosómico que la original.
Procambium: Tejido meristemático que aparece tempranamente en el embrión, a partir del cual se originan los tejidos conductores primarios.
Meristemos radiculares
Terminal o apical
Laterales
Adventicias (pueden estar formados por un organo distinto de raíz, tallo u hoja).
· Meristemos caulinares:
o Terminal
o Axilar (de una hoja o bráctea)
o Adventicias (puede estar formados en un entrenudo del tallo, de una hoja, raíz etc).

7. ¿Cómo se clasifican los meristemas secundarios?
a. Cambium vascular – es un meristemo lateral formado por monocapas cilíndricas de células en tallos y raíces.
b. Cambium fascicular—es el cambium vascular se forma a partir del cambium situado en el xilema y en el floema.
c. Cambiun suberogeno o felógeno—meristema lateral presente en los tallos y raíces.

8. ¿Cómo se origina el cambium vascular?
Se origina por una monocapa cilíndrica de células situada en aquellos tallos y raíces que van a sufrir un engrosamiento secundario. El cambium vascular del tallo se forma de la siguiente manera:
A partir de células de procambium presentes en el xilema 1 y en el floema 1, dando lugar al cambium fascicular, bien por desdiferenciación de células parenquimáticas de los radios medulares, dando lugar al cambium interfascicular

9. ¿Dónde se encuentran los meristemos intercalares?
Se encuentran en la base de los entrenudos de las ramas, tallos (numerosas monocotiledoneas), en el escapo floral o en la hoja. Se encuentran situados entre dos regiones de tejidos diferenciados y permiten una elongación más o menos importante.


10. Comparar los meristemas:

Meristema apical
Meristema caulinar
Meristema apical radicular
Ápices de tallos, raíces, glándulas, brotes.
Crecimiento del tallo, ramas y hojas.
Crecimiento de las raíces.

Apical incluye caulinar y este incluye apical radicular (crecimiento).

11. ¿Cómo se diferencia morfológicamente y estructuralmente los meristemos?
Criptogamas: se observa una gruesa célula Terminal, la célula inicial que suministrara las otras células del meristemo por divisiones en ambos o varios planos.
Gimnospermas: la estructura es totalmente diferente. Se observa en la región apical hileras apicales.
Angiospermas: la morfología del meristemo y su estructura son igualmente variables. El meristemo es plano y el de la raíz es mas alargado, los meristemos axilares se desarrollan precozmente.

12. ¿Cuál es el tejido meristemático que da origen a las raíces laterales? ¿Qué otro tejido la origina?
Meristemos apicales—situados en ápices de brotes y raíces (tanto principales como laterales)
Meristemas radicales o radiculares.

13. ¿Dónde están situados los centros quiescentes?
Los centros quiescentes están situados por debajo de las células generatrices de la cofia. Las células del centro quiescentes presentan una actividad mitótica débil o nula; sin embargo, son capaces de dividirse en ciertas circunstancias (tratamientos con frió). En algunos casos los centros quiescentes de las raíces jóvenes no es visible; se desarrollaran más tardíamente.

14. ¿Qué son meristemas de neoformación?
La neoformación es un esbozo de raíz a partir de células pericíclicas o la de un esbozo de yema a partir de un fragmento de hoja necesita una desdiferenciación acompañada de una reanudación de la actividad mitótica.

15. ¿Qué son las yemas?
Las yemas son las estructuras encargadas del crecimiento del tallo, aunque también pueden ser hojas y ramificaciones.

16. ¿Cómo se clasifican las yemas?
Se clasifican en:
Yemas terminales: situadas en el extremo del eje
Yemas escamas: situadas en el ápice protegido de escamas
Yemas desnudas: situadas en el tallo.
Yemas axilares: situadas en la axila de cada hoja. Se dividen en yemas senales, se originan en la parte alta de la axila y yema colateral localizada al lado de otra axila.
Yemas durmientes: se originan en la corteza del tronco
Yemas adventicias: se originan en la superficie, formándose en la epidermis o profundas en tejidos

17. ¿Qué son gémulas? ¿A qué dan origen?
R: Son las yemas iniciales del embrión, por lo tanto dan origen a la yema principal de la planta.

18. ¿Qué suponía la teoría de los histoganos? ¿Quién es su autor?
Todos contribuyen (meristema) a la construcción de la arquitectura de la planta. Pero no poseen todos la misma significación desde el punto de vista de la ontogénesis. Algunos son: histogenos y otros organógenose

La teoría de la histogenos, esta generalmente abandonada, suponía la existencia de 3 capas de células inciciales en el meristema apical. Estas capaz histogenas son: dermatogeno, periblema y pleroma.

Autor Hanstein 1868, citado por Clouses 1959.

19. ¿Dónde se producen las yemas adventicias?
En condiciones naturales, las ramificaciones que provienen de la neoformación de yemas adventicias a nivel de raíz son típicamente retóricas no solo frecuentes en las leñosas, sino también en especies herbáceas.
Las yemas adventicias se producen sobre las raíces, tallo, hipocólitos y hojas.
Las hojas de Kalanchoe las forman en las escotaduras de la margen foliar.

20. ¿En cuales especies son comunes las yemas adventicias de la raíz?
En leñosas (Lilias, avellanas zarzamora), en herbáceas (Isatis tinctoria), Kalanchoe.

21. ¿Qué pueden producir los tejidos de las inflorescencias?
Produce yemas adventicias de forma espontánea
Desarrollo de Bulbillas de inflorescencias especialmente entre los Alliom.

22. ¿Qué es la dominancia apical?
Los estudios de la multiplicación esta estrechamente unido a los diversos aspectos de la morfogénesis. La diferenciación de las yemas axilares implica la ruptura de la dominancia apical, es decir de la inhibición del crecimiento de las yemas axilares ejercida por la yema Terminal. La forma de crecimiento del retoño plagiotropo (u horizontal), ortotropo (o erguido), la tuberización, el letargo de la yemas, la inducción floral y las posibilidades de reversión son tantos otros aspectos de la fisiología del crecimiento y del desarrollo que interfieren con la propagación.

23. ¿Como eluden las yemas la dominancia apical?
Las yemas eluden la dominancia apical debido a que es el meristemo apical como tal el encargado del crecimiento vertical de la planta.
Un factor importante reside en la intensidad de la dominancia apical; es decir, la inhibición del crecimiento ejercida por la yema Terminal sobre las axilares. Las yemas que aseguran la propagación deben eludir la dominancia. Esta condición puede realizarse de formas muy diferentes. Las yemas de las bases de los tallos esquivan la dominancia como consecuencia de su alejamiento de los apicales. La inducción floral viene frecuentemente acompañada de una ruptura más o menos completa de la dominancia apical, lo que puede entrañar a veces el desarrollo de yemas vegetativas sobre tallos floríferos. Así mismo, las yemas pueden eludir la inhibición correlativa, cuando nacen en órganos, en vía de envejecimiento.


BIBLIOGRAFÍA

Morfología de plantas vasculares. Tema 10: Clasificación de Tejidos Meristemashttp://images.google.com.co/imgres?imgurl=http://www.biologia.edu.ar/botanica

C:\Documents and Settings\Usuario..xp\Mis documentos\T VEGTAL\ Meristemas.DOC

MERISTEMAS

Las plantas con flores presentan un conjunto de adaptaciones reproductoras mas adecuadas a la vida terrestre. La fecundación se libera totalmente del medio externo con acceso directo de los gametos masculinos a la ovocélula o sus proximidades por medio de un sifón o tubo polínico (Izco et al 2004).


Ciclo vital de Melia azedarach, Paraíso, angiosperma.

Todo tejido meristemático surge de una célula embrionaria, por ejemplo:
oooo
o
oo
Meiosis
Citocinesis

Antera
oooo
oo
0
División Mitótica
oooo
oooo
0
0

Al arribar el polen al pistilo, que es el órgano femenino, se produce la polinización, con la consecuente formación del tubo polínico, que desciende por el estilo hacia el óvulo. El tubo polínico lleva dos núcleos haploides: el gameto masculino que se fusionará con el núcleo del saco embrionario que funciona como cigoto o huevo, para originar un nuevo organismo diploide, y otro que se fusionará con los dos núcleos polares del saco embrionario para formar un tejido triploide, el endospermo. Este proceso se conoce como doble fecundación. http://bibliotecadigital.ilce.edu.mx/sites/ciencia/volumen3/ciencia3/157/htm/sec_5.htm
Plúmula
Hoja primaria o unifoliadas

Epicotilo
Radícula
Hipocotilo

Los tejidos meristemáticos dan origen al crecimiento primario y secundario. El crecimiento primario da origen al crecimiento longitudinal y este se presenta en las monocotiledoneas, mientras que el crecimiento secundario da origen al crecimiento diametral o en grosor y este se ve el las dicotiledoneas.

Tejidos involucrados en el crecimiento primario son:

El meristema apical se divide en dos: caulinar (tallo, ramas y hojas) y radicular (raíces). Este meristema apical también involucra las yemas apicales y axilares.

El meristema secundario da origen al cambium y meristemo intercalar, y este ayuda al crecimiento de las hojas.

Características de las células meristemáticas:

Son pequeñas.
Pocas mitocondrias, ya que estas viven a expensas de las demás células.
Presentan un alto número de ribosomas (para sintetizar).
Núcleo grande para una división constante.
Bajo contenido de plastidios.

Totipotencia: Es la capacidad que tiene cualquier célula para dar origen a todos los tipos de células diferenciadas de un organismo.

El crecimiento o la división de las plantas dependen de la totipotencia, la cual tiene unos pasos.

1. Desdiferenciación: Para que las plantas se formen necesitan desdiferenciarse. Es decir, genéticamente las plantas reciben una orden para sintetizar un sustancia que es vital para la misma; si se retira una parte de la planta y se desea sembrar ésta sufre un paro, puesto que la información se interrumpe, después esta comenzará de nuevo a sintetizarse hasta que haya una diferenciación y por lo tanto salga un callo.

2. Diferenciación: Cuando el callo esta formado comienza a verse una diferenciación.

3. Polaridad: Es el transporte diferenciado o determinado por una sustancia.

4. Elongación: Es el alargamiento que sufre la planta.

Para tener un explante en condiciones óptimas es importante regular el medio de cultivo y el medio físico.

En el área física se debe regular los gases (CO2, O2, C2H4), la luz (cantidad x productrividad), la temperatura y la humedad relativa.

En el medio de cultivo hay que regular la composición organica el agua, la composición inorganica, el agente gelificante, pH, temperatura especifica y luz.




¿QUÉ DEBE TENER UN LABORATORIO PARA CULTIVO DE TEJIDO VEGETAL?

El cultivo de tejido in vitro es un conjunto de técnicas que permiten el cultivo, en condiciones asépticas de órganos, tejidos, células y protoplastos, empleando medios nutritivos, y proporcionándole artificialmente las condiciones físicas y químicas apropiadas para que las células expresen su potencial intrínseco o inducido.

Estos principios son básicamente invariables en todos los laboratorios de cultivo de tejido vegetal, su aplicación puede presentar variaciones en magnitud y complejidad, dependiendo de los objetivos del laboratorio; así, mientras que un laboratorio de investigación puede ser pequeño en tamaño pero muy especializado en equipos e instalaciones, uno de producción comercial tiende a ser más grande y simple. Un laboratorio de investigación puede también tener un rol de enseñanza y, en este caso, es frecuente que se asignen en él áreas especiales para la enseñanza y la demostración (Roca & Mroginski___).

El laboratorio de cultivo de tejido debe disponer de un área destinada al establecimiento, crecimiento y multiplicación de las platas producidas.

Un laboratorio de cultivo de tejido se puede dividir esquemáticamente en áreas separadas para las diferentes funciones que se desarrollan en él. Las áreas o secciones principales son:
Área de preparación, almacén independiente, lavado, esterilización, tratamiento, incubación e invernadero. El baño y la oficina son lugar que no debe faltar.

Áreas de un laboratorio de cultivo vegetal.

1. Área para la recepción de muestras:
Área física puede estar incluida en el área de preparación de medios o estar separada de ella.
Lavaplatos con agua fría y caliente.
Botellas para el almacenamiento de agua destilada.
El mesón debe tener una altura y un material determinado.
Estantería.
Cestas para desechos orgánicos e inorgánicas.

Aquí se obtiene el lavado, la obtención del explante y la desinfección.

Equipos:
Podadoras.
Bisturí.
Estereoscopio.
Nevera.

Para la bioseguridad es necesario de un extintor, botiquín, equipos de primeros auxilios, duchas y lavadoras de ojos.

Reactivos:
Agua abundante y de buena calidad.
Jabón detergente o antibacterial (líquido y en polvo).
Alcohol a 70 y 90%.
Hipoclorito de sodio.
Hipoclorito de calcio (si el explante es muy delicado no se debe usar).
Bicloruro de mercurio (toxico).

2. Área para la preparación de medio de cultivo
Área fisica de 4.6 X 3.6 metros.
Lava platos.
Calidad y dirección del aire.
Libre de contaminantes.

Equipos
Nevera (independiente).
Incubadora.
Destilador.
Desionizador.
Agitador magnético con imanes y plancha de calentamiento.
pH- metro 5.6 - 5.8.
balanza, graneras y de precisión.
Estufa eléctrica.
Autoclave (medios, equipos de disección y atuendo).
Dispensador de medio de cultivo.
Estantería, vidrieria y material de plastico.

Reactivos
Macrosales (cantidades grandes).
Microsales (cantidades pequeñas).
Sacarosa.
Gelificante.
Fitohormona (citoquininas, giberelinas, auxinas).
Antibióticos.
Carbón activado (oscurece el medio de cultivo).

3. Área de siembra o transferencia
Área física de 2.4 X 3.6 metros
Aislada con pocas corrientes de aire, alejado de puertas.
Superficies lavables y de fácil desinfección.
Mesones.
Estantería.

Equipos
Cabinas de flujo laminar.
Mechero.
Estereoscopio.
Equipo de disección.
Carro.

Reactivos
Alcohol antiséptico 70%.
Hipoclorito de sodio.
Agua destilada y estéril.

4. Área de cuarto de crecimiento
Área física de 5.4 X 3.6 metros.
Aislado a temperaturas entre 24 a 29ºC.
Humedad relativa entre 70 a 80%.
16 horas luz por 8 horas de oscuridad.
Electricidad en 110V y 220V.
Seguridad contra incendios o calentamiento excesivo.
Superficies lavables y desinfectables.
Iluminación en techos y estanterías.
Acceso restringido.

Equipos
Temporizador.
Aire acondicionado o extractor de aire.
Sistema de inmersión temporal.
Planta eléctrica.
Estantería.
Lámparas.

Reactivos
Alcohol antiséptico 70%.
Hipoclorito de sodio.
Hipoclorito de calcio.

5. Área de aclimatación
Área física.
Condiciones de invernadero.
Casa de malla.

Equipos
Motor.
Sistema de riego.

Reactivos
Agua.
Enraizadotes.
Vermiculita.
Turba, tierra y arena.
6. Vivero

Equipos
· Regaderas manuales o sistemas de riego.

Reactivos
· Enraizadotes.
· Fertilizantes.
· Insecticidas.
· Fungicidas.

MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo constituyen un elemento fundamental para el cultivo “in vitro” de células, tejidos, protoplastos, anteras y para lograr el desarrollo de embriones, embrioides, la organogénesis, la micropropagación, etc. Los medios de cultivo tienen una serie de componentes generales y específicos cuya presencia y concentración estará en dependencia del objetivo que se persiga en su utilización. Así, los medios de cultivo pueden ser líquidos o tener un soporte sólido, tienen sustancias minerales, vitaminas, aminoácidos, azúcares, fitohormonas, etc. También pueden contener por ejemplo extractos naturales, según su finalidad y debe quedar claro que no todos llevan un complemento completo de todos los factores.
(http://fbio.uh.cu/webfv/docencia/tema%205.doc)

En el cultivo in vitro de tejidos vegetales, se denomina solución madre o stock a cualquier solución de composición elevada y concentración definida, en la que el soluto puede ser uno o más compuestos químicos de los que conforman un determinado medio de cultivo y que mediante un proceso de dilución permita la preparación de 1 litro de medio de cultivo. (Pierik, 1990)

Desde el punto de vista práctico la preparación de soluciones madres o stock tiene como finalidad evitar:

Pesar cada uno de los compuestos químicos que constituyen un medio de cultivo, cada vez que se requiera elaborar, lo que implicaría evitar demasiado tiempo en su preparación.

Inexactitud al pesar cantidades muy pequeñas de ciertos compuestos químicos.

Otro aspecto importante que se debe considerar es la cantidad de agua que se utilice para disolver las sales inorgánicas que constituyen las soluciones stock y en general el medio de cultivo.

El agua debe ser destilada o bidestilada y necesariamente des ionizada. (Kyte & Kleyn, 1996)

Se han creados numeroso medios de cultivos (medio basal), cuyas diferencias estriban en las cantidades y tipos de sales empleadas.Entre los medios de cultivo más conocidos se encuentran:

Murashige y Skoog (MS) (1962),
Linsmaier y Skoog (LS) (1965),
Borgin y Nitsch (BN) (1967),
Gamborg (B5) (1970),
Sachs (1860), Knop (1865),
Arnon y hoglan (1940),
Gautheret (1942), Riquer y Duggar (1946),
Heller (1953-58)
Nitsch y Nitsch (1956),
Torrey y Shigemura (1957-64),
White (1963),
Blaydes (1966),
Miller y Oyima (1968).

SALES INORGANICAS

MACRONUTRIENTES
Los elementos minerales son muy importantes para la vida de las plantas.

— Nitrógeno (N): forma parte de aminoácidos, vitaminas, proteínas y ácidos nucleíco.

— Magnesio (Mg): es parte de la molécula de clorofila y de los ribosomas

— .Calcio (Ca): Es constituyente de la pared celular. Interviene en respuesta de crecimiento,

— Fosforo (P): Forma parte de las moléculas que almacenan y transfieren la energía química de los ácidos nucleicos, de este depende la energía celular.

— Potasio (K): Desempeña un papel importante en la regulación osmótica y en la actividad enzimática.

— Azufre (S): Necesario para sintetizar algunos aminoácidos

— Sodio (Na): Es necesario en el cultivo in vitro de halófilas y en plantas cuyos productos fotosintéticos son C4 y plantas con metabolismo acido. (García, 2000)

Micronutrientes
Estos micronutrientes son importantes en las células vegetales, ya que al adicionarles ciertas cantidades excesivamente pequeñas permite que las sales madres sean mas eficaz para el medio de cultivo.

Hierro (Fe): forma el núcleo del citocromo y parte de la ferrodoxina.

Molibdato (Mo): fundamental para la actividad de la nitroreductasa

Manganeso (Mn): induce a la síntesis de clorofila, se requiere para la formación del O2 en la fotosíntesis.

Boro (B): Necesario para el sostenimiento de la actividad meristematica, involucrado en la síntesis de bases nitrogenadas como el uracilo.
— Cobre (Cu): permite la oxidación respiratoria final, esta ligado al proceso de lignificación.

— Zinc (Zn): requerido para la oxidación e hidroxilación de compuestos fenolicos.

— Cobalto (Co): componente de la vitamina B12

— Cloro (Cl): fundamental en reacciones que llevan a la evolución del O2 en la fotosíntesis. (García, 2000)

REGULADORES DE CRECIMIENTOS

Adicionalmente a los nutrientes, generalmente es necesario agregar una o más sustancias reguladoras; frecuentemente Auxinas y/o Citoquininas, pero a veces también Giberelinas o ácido ascórbico, para mejorar el desarrollo del cultivo in vitro de tejidos y órganos. Por otro lado, los requerimientos de estas sustancias varían considerablemente con los tipos de tejidos y los niveles endógenos de estos reguladores, así como con la finalidad del cultivo in vitro.

El uso de fitoreguladores en los cultivos in vitro es de gran importancia por cuanto Se ha demostrado que la clase y concentración de dichas sustancias interactúan con el genoma de la planta. (Montoya, 1991)

Auxinas

Son utilizadas principalmente para la diferenciación de raíces y la inducción de callo. Las más utilizadas son:

IBA: (ácido indol-3-butírico) = diferenciación de raíces
ANA: (ácido naftalenacético) = diferenciación de raíces
IAA: (ácido indolacético) = Prolongación de explantes
2,4-D: (ácido diclorofenoxiacético) = inducción de callos.

(Las Auxinas se disuelven usualmente en etanol diluido o en una solución de hidróxido de sodio).

Citoquininas

Promueve la división celular y la inducción de yemas adventicias en callos y órganos. Brotación.
— Las Citoquininas más usadas son:
— BAP: (bencilamino purina)
— Kinetina
— 2-ip (isopentenil-adenina).
(Generalmente son diluidas con ácido clorhídrico o hidróxido de sodio).

Giberelinas

Su función principal es alargar las regiones subapicales del explante. La giberelina con mayor uso es: El GA3: pero se debe tener en cuenta que es muy sensible al calor (pierde el 90% de su actividad después del autoclavado)

Comparado con las Auxinas y Citoquininas, las giberelinas se utilizan raramente. La mayoría de los explantes sintetizan cantidades suficientes de este grupo de hormonas.

Acido abscísico

El ácido abscísico (ABA) en la mayor parte de los casos produce un efecto negativo en los cultivos in vitro, pero en determinados casos promueve la maduración de embriones, y en cultivos de células en suspensión facilita la sincronización de la división celular.

Etileno

Interviene en procesos como: liberación de la dormancia, crecimiento y diferenciación de brotes y raíces, formación de raíces adventicias, abscisión de hojas, flores y frutos, inducción de floración en algunas plantas, senescencia de hojas, flores y maduración de frutos.

Vitaminas

La mayor parte de las plantas sintetizan casi todas las vitaminas esenciales, pero aparentemente lo hacen en cantidades infraóptimas. Para lograr un buen crecimiento es necesario a menudo suplir al medio con una o más vitaminas.
La tiamina (B1) es la que más se utiliza y se la considera un ingrediente esencial. Otras vitaminas también han demostrado tener un efecto positivo en el crecimiento in vitro, como son: pidiroxina (B6), ácido nicotínico (B3), pantotenato cálcico (B5).

Fuentes de carbono

Normalmente para el cultivo in vitro de células, tejidos u órganos es necesario adicionar una fuente de carbono en el medio, debido a que el crecimiento in vitro tiene lugar en condiciones poco apropiadas para la fotosíntesis o incluso en oscuridad.

La sacarosa es la más utilizada para propósitos de Micropropagacion.

Generalmente se usan concentraciones de 1 -6% de sacarosa en el medio, aquí es convertida rápidamente en glucosa y fructosa; la glucosa es la que primero se utiliza seguida de la fructosa.

El azúcar blanco refinado que se vende en los supermercados puede resultar adecuado para la Micropropagación en muchos casos.

Azucares

Los azucares en el medio cumplen dos funciones esenciales:

— Son fuentes de energía.
— Mantienen en el medio un potencial osmótico determinado.


AGENTES GELIFICANTES

Agar: Es una mezcla de polisacáridos extraídos de un alga marina. Tiene una elevada masa molecular, como también la capacidad de hidratarse y formar una red. La planta no puede digerirlo ni absorberlo, además no interactúa con los componentes nutritivos del medio. El Agar se funde a altas temperaturas (1000C), solidifica alrededor de los 400C y no se degrada con la luz. Generalmente se utiliza a una concentración de 0,6 - 1%. El principal problema con este gelificante es su elevado costo.

Gelrita: Es un heteropolisacárido aniónico natural producido por una bacteria, que forma geles semejantes al Agar. Se puede usar a una concentración de 0,15-0,30%. Los geles de gelrita son notablemente más claros que los de Agar, y también cuajan más rápidamente. (García, 2000)

PROTOCOLO DE DESINFECCIÓN

Protocolo de desinfección para yemas de mora de castilla

1. Introducir hipoclorito al 1%
Detergente.
BAP 2mg.
Tween 20%
Yodo 5ml.
Ácido ascórbico 2mg/l durante 15 minutos.
Enjuagar con agua destilada.
Pasar a cámara.
Sumergir en alcohol al 70% por 2 minutos.
Enjuagar.
Hipoclorito al 3% por 5 minutos.
Enjuagar.
Sembrar.



2. Hipoclorito al 5% por 20 minutos.
Enjuagar.
Alcohol al 70% por 5 minutos.
Enjuagar.
Hipoclorito al 5%
Ácido ascórbico 2mg/l durante 5 minutos.
Enjuagar.
Tween 20 por 5 minutos.
Enjuagar y sembrar.


Desinfección del explante: brotes de tubérculos, aproximadamente de 2-3 cm de longitud y de 4-5 nudos/brote.

· Lavar los brotes bajo agua corriente.
· Sumergirlos en una solución de agua lavandina comercial (55 g Cl/l) al 20% más una o dos gotitas de Tween 20, durante 15 minutos agitando suavemente.
· En cámara de flujo, extraer los brotes y enjuagarlos con agua estéril durante 15 minutos divididos en enjuagues sucesivos de 5’ c/u.
· Colocar los brotes sobre papel de filtro estéril hasta la siembra.

Meristemas de plátano y banano

Alcohol al 70% 5minutos.
Hipoclorito 3% por 10 minutos
Enjuagar en cámara de siembra.
Hipoclorito 1% por 5 minutos en cámara, enjuagar.
Sembrar.

Cápsula de orquídeas

Lavar cápsula con jabón
Enjuagar.
Sumergir cápsula en hipoclorito 1% con una gota de detergente por 10 minutos.
Transferir la cápsula a la cámara de siembra.
Sumergir en alcohol al 100% por tres minutos.
Enjuagar y sembrar.

Bromelias (piña)

1ml de fungicida (Benomil) por 15 minutos.
Alcohol al 25% más ácido ascórbico (2mg/l) por 2 minutos.
Purseu 25% mas ácido ascórbico (2mg/l) por 2 minutos.
Alcohol al 25% por 5 minutos.
Enjuagar y sembrar


Anturio

Alcohol al 70% por 10 minutos
Hipoclorito 5% por 20 minutos.
Enjuagar en cámara (agua esteril).
Hipoclorito 3 % por 2 minutos enjuagar y sembrar.

Rosa y clavel

Alcohol 70% por 5 minutos.
Hipoclorito 3% por 10 minutos.
Hipoclorito 5% por 10 minutos.
Enjuagar en cámara (agua estéril).
Hipoclorito 1% por 3 minutos.
Enjuagar y sembrar.

Estacas de olivo

Sumergir las estacas en etanol al 80% a 96ºC por 2-3 segundos.
Hipoclorito de sodio por 20 minutos. Llevelo al agitador magnético a 37 (1ºC).
Enjuagar 3 vece con agua destilada estéri.
Deje secar y siembre.

Desinfección de cápsulas de orquídeas

· Etanol 70º (5 minutos),
· Solución de NaOCl al 3,3% más el agregado de dos gotas de Tritón
· 100â, durante 30 minutos en agitación.
· Finalmente, las cápsulas fueron sumergidas en etanol y flameadas.

Desinfección de cápsulas de orquídeas

Detergente al 1% y sumergidas 5 minutos en solución de hipoclorito de sodio (NaOCl) al 1 % de cloro activo al que se le añaden dos gotas de Tween 20.
Lavar con agua destilada estéril.
En la cabina de flujo laminarse sumergir las cápsulas en solución de sulfato de cobre al 2% durante cinco minutos
Hipoclorito de sodio (NaOCl) al 1 %, y finalmente se enjuagaron con suficiente agua destilada estéril.
Antes de ser seccionadas, las cápsulas fueron pasadas por alcohol al 70% y flameadas.

Explante de cerezo (Prunus avinum) Miller 1982

Remojar los explantes en una solución de hipoclorito de sodio al 5% con 0.1% de tween 20 por 10 minutos.
Dos enjuagues de 5 minutos cada uno con agua destilada, desionizada o estéril.
Remoje los explantes en etanol al 70% por 5 minutos
Enjuague dos veces, cada enjuague por 5 minutos con agua destilada, desionizada o estéril.

Kewiña (Polyepis besseri Hieron)

· Hipoclorito de sodio al 2.5%. según el protocolote desinfección desarrollado por plantas leñosas.
· Testando diferentes tiempos (15, 20 y 25 minutos).
· Formol al 37% durante (15, 20 y 25 minutos).

Especies Proteáceas

· Explantes de 10-15 cms aproximadamente se pusieron en solución de 3 g/L de
· captan por 45 minutos.
· Se sumergen 5 segundos en etanol 70%.
· Dos enjuagues en agua destilada esterilizada.
· Se traspasan a hipoclorito de sodio al 1% por 15 minutos la mitad de los explante y la otra mitad se traspasa a una solución de hipoclorito de sodio al 0,75% por 15 minutos, ambas en constante agitación.
· Enjuague en agua destilada esterilizada.
· Se cortan los explantes de 2-3 nudos cada uno, bajo condiciones asépticas.

Nothofagus procera (embriones aislados)

· Etanol al 70% v/v durante 3 minutos,
· Tres enjuagues de 2 minutos cada uno, con agua destilada estéril.
· Luego las semillas fueron inmersas en una solución de hipoclorito de sodio, con un 2% de cloro activo durante 20 minutos, para luego realizar tres enjuagues con agua destilada estéril durante 2 minutos cada uno, todo lo anterior bajo agitación constante.

BIBLIOGRAFÍA

Vidoz, M. L. - Flachsland, Eduardo A. - Rey, Hebe &. - Mroginski, Luis A___
Comportamiento ex vitro de Plantas de Brassavola perrinii (Orchidaceae)
y de Tres Híbridos Intergenéricos

http://www.unne.edu.ar/Web/cyt/cyt/agrarias/a-005.pdf

http://www.redbio.org/protocolos/papa_comun_1.htm

http://www.uclm.es/profesorado/porrasysoriano

http://www.puc.cl/agronomia/2_alumnos/ProyectosTitulos/pdf/CienciasVegetales/CarolinaTapia.pdf


MEDIOS DE CULTIVO

Medio de cultivo de Aloe vera

10 mL de medio de cultivo constituido por: 50% de las sales del medio de cultivo Murashige y Skoog (MS) (11),
1 mg.L-1 de tiamina-HCl,
100 mg.L-1 mioinositol,
25 mg.L 1 de cisteina,
100 mg.L-1 ácido ascórbico,
1 mg.L-1 de 6-benzylaminopurina (BAP),
30 g.L-1 de sacarosa y 10 g.L-1 de agar ajustando el pH a 5,8.
Los medios de

N. Albany, J. Vilchez, S. León de Sierralta, M. Molina y P. Chapín. _____Una metodología para la propagación in vitro de Aloe vera L. http://www.serbi.luz.edu.ve/pdf/fagro/v23n2/art_08.pdf

Cápsulas de orquídeas

Sales inorgánicas de Murashige y Skoog (1962) al 50% (MS), Knudson C (1946) (K), Vacin y Went (1949) (V W) o Morel (1965) (M) suplementados con agua de coco (10 %), sacarosa (2 %), carbón activado (0 y 0,15 %) y gelificado con 0.7 % de agar técnico

Callos de orquídeas

García M, J. Hernández G. R.___.Estudio de algunos medios de cultivo para la inducción de brotes en callos de orquídea terrestre (Blettia purpúrea). http://www.maa.gba.gov.ar/agricultura_ganaderia/floricultura/MACRO%20MICRO%20PROPAG/25.doc

Musa (Heliconias)

Se utilizó un medio de cultivo en estado líquido con soporte de papel de filtro basado en las sales MS, con 20 g de sacarosa y 0.5 mg.l-1 de tiamina suplementado con 2.0 mg.l-1 de 6-BAP.

El medio de cultivo utilizado fue el de MS modificado por Zárraga y Granada (1990), suplementando con 30 g de sacarosa, 1.0 mg.l-1 de tiamina, 3.0 mg.l-1 de 6-BAP y 4 g/l de agar.

MS suplementado con 1.0 mg.l-1 de tiamina, 100 mg.l-1 de myoinositol, 1.3 mg.l-1 de AIA y 4% de sacarosa. Martínez (1995
http://rutas.ucf.edu.cu/Tesis%20Maestria/tesis%20Flora%20M%20Sosa.pdf

Protocormos de Encyclia oxypetala y Encyclia phoenicea

Se utilizaron protocormos procedentes de semillas germinadas y las sales del medio de cultivo MS en estado líquido y semisólido con los suplementos 3.0 % de sacarosa, 15 % de agua de coco, 0.1 mg.l-1 de tiamina y para el estado semisólido 0,7% de agar, 0.15% de carbón activado y en ambos casos el pH fue ajustado a 5.6.

Embriones

25 ml de medio basal constituído por: macroelementos, microelementos y vitaminas de Dunstan y Short (BDS, 1977),
200 mg.L-1 de prolina,
500 mg.L-1 de mioinositol,
suplementado con 10% de sacarosa,
7g.L-1 de bacto-difco agar y
adicionado con 2 mg.L-1 de BAP y 2 mg.L-1 de 2,4-D.

LILIANA MARTÍNEZ (1), MARÍA TERESA PONCE (1) , MARÍA ELIS LÓPEZ (2) y CLAUDIO GALMARINI (3) .
MARTÍNEZ, L., PONCE, M. T.LÓPEZ, M, E., y GALMARINI, C..___ LA COLCHICINA Y EL APM PROMUEVEN LA LA COLCHICINA Y EL APM PROMUEVEN LA GINOG GINOGÉNESIS NESIS IN IN VITRO VITRO DE LA CEBOLLA DE LA CEBOLLA (Allium Allium cepa cepa L.) L.)
http://www.redbio.org/portal/encuentros/enc_2001/posters/01/posterpdf/01-171.pdf

Capítulos florales

Sales de MS reducidas a la mitad con la concentración de FeEDTA modificada a 1,5 X y con el agregado de (mgl-1): sulfato de adenina, 80; ácido indol acético
AIA, 0,1; 6-bencil adenina BA, 2 y sacarosa 10 g/L como únicos compuestos orgánicos. http://www.agro.unlp.edu.ar/revista/PDF/t103(2)_118.pdf


Embriogénesis somática de Cedro

Murashigue y Skoog suplementado con 3% de sucrosa, 2,4 g/l de Gelrite, 20 mg/l de la auxina 2,4-D filtrada y 50 ml/l de agua de coco. El pH fue ajustado a 5.6.

Especies forestales Pino

Citoquinina BAP (bencil-amino purina) en una concentración de 0.5 mg/l más ANA 0.3 mg/l, para pino blanco y para pinabete, BAP en una concentración de 0.5 mg/l

BIBLIOGRAFIA

Díaz L. P, Namur J .J. & Bollati S.A.____ Efecto del ácido cítrico y del carbón activado en la regeneración de plantas de orquídeas (Laelia lundii) por cultivo in vitro de semillas. http://www.maa.gba.gov.ar/agricultura_ganaderia/floricultura/ MACRO%20MICRO%20PROPAG/25.doc.


González S. S. ____MEDIOS DE CULTIVO http://fbio.uh.cu/webfv/docencia/tema%205.doc

RAMÍREZ A. E. 2007. “Propagación por cultivo de tejidos vegetales de tres especies de confieras (abies guatemalensis redher, pinus ayacahuite ehry pinus rudis endl) e inoculación con hongos micorricicos para inducir el enraizamiento in vitro y ex vitro de las plantas micropropagadas”


FASES DE LABORATORIO

1. Establecimiento:
Obtención del explante
Desinfección
Medio de cultivo
Incubación

2. Micropropagación
Cuando el medio requiere hacer micropropagación, es decir cuando el medio presenta gran cantidad de macollas o plántulas y el medio cuando el medio está desgastado.

3. Enraizamiento

4. Endurecimiento o aclimatación

5. Campo



Principales problemas en la incubación

Contaminación:
Hongos, bacterias, y si aparecen juntas (hongos y bacterias) es porque hay un mala desinfección.

Necrosis: esta muerte es debido a:
Tratamientos de desinfección agresivos
Herramientas calientes
Medio caliente
Daño del tejido con el corte

Fenolización: Es debido a la presencia de la polifenoloxidasas (enzimas), es decir a los polifenoles que son producidas por la vacuolas y se mezclan con los plastidios . Esto produceun ennegrecimiento del explante.
La oxidación se puede controlar con agentes antioxidantes tales como:
Ácido citrico, Carbón activado, L-cisteina, Polivinilpirrolidona, 4-hexilresorcinol, (HR), N-acetilcisteina (AC), ácido ascórbico (AA), ácido isoascórbico (AIA), sorbato de potasio (SP).

Los agentes antioxidantes se utilizan:
Antes y después de la disección del explante.
Agregar al medio de cultivo.
Mantener el explante en ácido ascórbico hasta la siembra.

pH: En el medio de cultivo se puede controlar el pH para evitar microorganismos que pueden atacar al explante.

ANEXO:
VITRIFICACIÓN:
Es conjunto de características físicas, que describen cambios en las hojas, tallo y raíces que les dan una apariencia cristalina, acuosa, húmeda y translúcida. Estos desórdenes, especialmente manifiestos en las hojas, afectan a dos de los procesos más importantes que realizan las hojas: la fotosíntesis y el intercambio gaseoso. Aunque en menor medida tallos y raíces también resultan afectados por estas anomalías anatómicas, que en ciertos casos van a impedir el normal establecimiento de plantas micropropagadas a condiciones ex vitro. (Encina____).

Las causas de estas malformaciones [(Ziv, Eds., Plant Tissue Culture and its Agricultural Applications. London. (1.986); Gaspard y col., Eds., Cell and Tissue Culture in Forestry, Vol. I, Dordrecht. (1.987) citado por Encina____] están todas ligadas a las especiales características del cultivo in vitro: factores nutricionales sobredimensionados y/o superfluos (elementos minerales, carbohidratos) y elevadas dosis de reguladores de crecimiento,, que producen un efecto subtóxico global; una baja intensidad luminosa durante la incubación; y la humedad relativa y un potencial hídrico, que según Deberg [IAPTC Newsletter 51: 2, (1987) citado por Encina____] son el factor clave para explicar estas complejas anormalidades morfogenéticas producidas in vitro.
Los estudios realizados sobre la vitrificación, señalan que los defectos anatómicos y fisiológicos observados, son el resultado de varias alteraciones en determinadas rutas metabólicas. Así los cambios en la síntesis de proteínas, afectan a varios enzimas implicados en la fotosíntesis (Rubisco), a la síntesis de celulosa y lignina (PAL, glucano sintetasa), y a procesos asociados a la producción de etileno (peroxidasas) (Encina____).
PROCESOS QUE AFECTAN LA INCUBACIÓN

Luz: Fotoperiodo (8-10 horas).
La longitud de onda y la intensidad lumínica deben ser tenidos en cuenta cuando se realiza el cultivo de tejidos (Montoya 1991).

La alternancia de luz y oscuridad debe ser estudiada en cada caso, a pesar de que en cultivo de tejidos, puede presentarse un requisito de fotoperiodo similar a las plantas crecidas extra vitro. Se ha demostrado en algunas plantas que la longitud del día influye los niveles endógenos de auxinas y citoquininas (Montoya 1991).

Temperatura: (28ºC)
Las temperaturas pueden variar de plantas a plantas. Se afirma que los tejidos de plantas tropicales puede esperarse mejor crecimiento a temperaturas mayores que las apropiadas para el cultivo de tejidos de plantas de zonas templadas (Montoya 1991).

En general en cultivo de tejidos se utilizan temperaturas que oscilan entre 24ºC y 28ºC (Montoya 1991).

Es importante además recordar la relación de la temperatura con eventos tales como la morfogénesis y las concentraciones y acción de los reguladores de crecimiento (Montoya 1991).

Humedad relativa:
Los cuartos de cultivo vegetal deben permanecer controlados con aproximadamente un 70% de humedad relativa (Montoya 1991).


BIBLIOGRAFÍA


Ruiz-Cruz, S. & González-Aguilar, G.A. ____Efecto de Agentes Antioxidantes y Envasado en Atmósferas Modificadas en la Calidad de Rodajas de Piña Fresca
Trabajo de tesis de maestría. http://www.ciad.mx/boletin/sepoct02/Efecto%20de
%20Agentes%20Antioxidantes%20y%20Envasado.pdf

Encina C. L.________. Vitrificación de plantas cultivadas in vitro http://www.encuentros.uma.es/encuentros28/28vitrificacion.html

Montoya, H. L. M. 1991. Cultivo de tejidos vegetales. Universidad Nacional de Colombia.


AGENTES CONTAMINANTES

El éxito de cultivo in vitro depende de la prevención y control de los agentes contaminantes como los hongos bacterias, virus, tiroides, microplasma, rickersias.

CAUSAS DE LA CONTAMINACIÓN

El explante y el ambiente
A nivel de tejidos, células, espacios intercelulares, haz vascular (endógenos).

Los agentes contaminantes no se expresan al principio del experimento, porque la presión osmótica es muy alta debido a la alta concentración de azúcar, a las sales y al pH.

Es importante conocer los microorganismos para así prevenir y controlar la contaminación.

PRUEBAS PARA CONOCER LOS AGENTES PATÓGENOS

Manuales (claves taxonómicas).
Bioquímicas
Ácidos grasos
PCR – AELP – RFLP

MANEJO DEL EXPLANTE

Obtención
Manipulación
Desinfección
Pruebas alternas

AMBIENTE (FACTORES DONDE SE ENCUENTRAN LOS MICROORGANISMOS)

1. Locativo
Esta área se separa para evitar que se formen focos de contaminación.
Buen diseño arquitectonico (evitar el cruce de áreas).
Circulación del aire puesto que en el suelo están presentes microorganismos, esporas.
Aire acondicionado (allí se pueden alojar microorganismos).

2. Operarios
Higiene
Tos, estornudo y conversación

3. Medio de cultivo
Autoclave reposo y observación a las 24 – 72 horas se comienzan a expresar las bacterias y microorganismos que soportan las condiciones del autoclave.

4. Herramientas
Esterilización
Flameo constante
(Agramante sustituyo el flameo por el hipoclorito).

5. Cabinas / sitio de almacenamiento
UV – desinfección – limpieza – mantenimiento.
Los filtro se cambian cada dos años.

MECANISMOS DE CONTROL DE CALIDAD DEN CULTIVO IN VITRO

Planeación
Programación
Evaluación

MICROPROPAGACIÓN

La Micropropagación es una biotecnología que se aplica a especies vegetales con el fin de obtener una población en el menor período de tiempo posible.
Se la conoce como una biotecnología de «respuesta rápida», puesto que se logran resultados en períodos de 3 a 6 meses, en contraposición con otras biotecnologías en las que el tiempo de investigación es mayor, (Ingeniería genética). (http://www.sica.gov.ec).
Se puede decir, que es además versátil puesto que se adapta a los requerimientos de cada especie en estudio, al aprovechar al máximo la totipotencia celular, para canalizarla hacia la propagación (http://www.sica.gov.ec).

VENTAJAS

Las micropropagación implica que solamente se necesita in espacio pequeño para mantener y multiplicar un gran número de plantas.

Se lleva a cabo en condiciones asépticas, es decir plantas libres de patógenos.

Producción de plantulas idénticas, con alto vigor y libres de plagas.

Pueden producirse clones de muchas plantas que de otra manera serian lentas y difícil (o imposible), por medio de la micropropagación vegetativa.

Por otra parte, la tasa de crecimiento es exponencial y finalmente el material obtenido es uniforme.

Un beneficio adicional que se desprende de la utilización de cualquier biotecnología es que incrementa el conocimiento local generando una independencia con respecto a los centros clásicos de generación.

DESVENTAJAS

Reducción de la variabilidad genética de las especies estudiadas.

Las plantulas pueden mostrar características poco convenientes in vivo.

Excesiva producción de ramas laterales.

Para el éxito se requieren buenas habilidades en el manejo del material.

Las facilidades e instalaciones son costosas.

APLICACIONES

Propagación de plantas que presenta un grado de vulnerabilidad o esta en peligro de extinción.

Características de las plantas propagadas in vitro.

Son cultivadas bajo condiciones de asepsia.

Permanecen en ambientes controlados.

Su crecimiento requiere de fuentes de carbono exógeno, es decir heterótrofos.

Actividad fotosintética baja.

Desarrollo y aumento de humedad relativa.

FASE DE ESTABLECIMIENTO
FASE 0 : Preparacion de la planta madre
FASE I : Establecimiento del cultivo en condiciones de asepsia
FASE II : Multiplicación de brotes
FASE III : Enraizamiento
FASE IV: Aclimatación
FASE 0: PREPARACIÓN DE LA PLANTA MADRE
Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener explantes con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado.
Para obtener estos explantes es recomendable mantener a las plantas madre un período de tiempo que puede oscilar entre unas semanas o varios meses, en un invernadero, en que se va a intentar cultivar la planta en condiciones sanitarias óptimas y con un control de la nutrición, del fotoperíodo y de la irradiancia recibida (http://www.unizar.es).
FASE I: ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO EN CONDICIONES DE ASEPSIA

Una vez escogida la planta madre, se extraerán los fragmentos a partir de los cuales se obtendrán los explantes.
Antes de extraer los explantes se hará una desinfección de los fragmentos de planta madre para eliminar los contaminantes externos. Una vez desinfectado el material vegetal, se debe mantener en condiciones de asepsia.
Ya en condiciones de asepsia (se trabajará en cabinas de flujo laminar) se extraerán los explantes del material vegetal y se pondrán en cultivo en un medio de iniciación dentro de un tubo de cultivo, para poder controlar la sanidad y la viabilidad de los explantes (http://www.unizar.es).

FASE II: MULTIPLICACIÓN DE LOS BROTES

Durante esta fase se espera que los explantes que sobrevivieron de la FASE I originen brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varios entrenudos.
Periódicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados. Estas operaciones se realizan en la cámara de flujo laminar. (http://www.unizar.es).

FASE III: ELECCIÓN DE UN MEDIO DE ENRAIZAMIENTO DE LOS EXPLANTOS

Para enraizar los explantes se utilizan principalmente dos métodos:
ENRAIZAMIENTO IN VITRO

Se transfieren los brotes obtenidos durante la fase de multiplicación a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga auxinas. Esta operación se realiza en la cámara de flujo laminar. Este método permite ser mas flexible a la hora de escoger los brotes, ya que éstos obtienen del medio la fuente de energía para enraizar, y por tanto no es necesario que tengan las hojas muy bien desarrolladas para realizar la fotosíntesis(http://www.unizar.es).

ENRAIZAMIENTO EX VITRO
Los explantes se deben transferir a un sustrato limpio, aunque no necesariamente estéril, que puede ser una mezcla de turba con perlita o vermiculita.Con este método es necesario que el medio de enraizamiento esté libre de organismos patógenos y que los brotes tengan las hojas bien desarrolladas, ya que deben realizar fotosíntesis para que la planta tenga una fuente de energía para enraizar y desarrollarse.Los explantes deben de plantarse en contenedores cubiertos por un plástico, para mantener la humedad relativa elevada, y hacerlos enraizar en el laboratorio, o ponerlos en 'multipots' dentro de un invernadero en un área sombreada con "fog-system" o "mist-system" (http://www.unizar.es).
FASE IV: ACLIMATACIÓN DE LOS EXPLANTOS ENRAIZADOS

Los explantes recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso dependen de la aclimatación.


TECNICAS AVANZADAS PARA EL DIAGNOSTICO DE FITOPATÓGENOS

Como se puede identificar el agente causal de una enfermedad en una muestra.

Examinar muestra de plantas
Planteando o formulando hipótesis

Relacionar los síntomas con las estructuras.

Técnicas de diagnostico

Pruebas de inmunoenzimáticas (TISSUE, Elisa).
Pruebas moleculares (PCR sencilla, anidada, RT- PCR, RFLP).

Pruebas de inmunoenzimáticas
En esta prueba se genera un anticuerpo y se deja incubar, posteriormente se le adiciona la muestra (hoja, tallo), y se le pones un conjugador que es una anticuerpo mas una enzima.

Pruebas moleculares
La Reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (Polymerase Chain Reaction), es una técnica de biología molecular descrita en 1986 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento.
Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN. Tras la amplificación, resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad virus o bacterias causante de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.
(http://es.wikipedia.org).

Ciclo de amplificación
La PCR básica consta de un primer paso de calentamiento hasta 94-95ºC durante 5-10 minutos, en el cual se activa la ADN polimerasa, en caso de necesitarlo. En este paso también se evita la unión inespecífica de los cebadores (también denominados partidores o primers) al ADN molde.
Posteriormente tiene tres pasos que se repiten muchas veces dependiendo de lo que se desee amplificar:

1. Desnaturalización
En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos hebras de las cuales está constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95ºC) de la muestra la forma más habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la denaturación depende, por ejemplo, de la proporción de G+C que tenga la hebra, como también del largo de la misma. Otros métodos, raramente empleados en la técnica de la PCR, serían la adición de sales o agentes químicos capaces de realizar la desnaturalización.

2. Unión del cebador
A continuación se producirá la hibridación del cebador, es decir, el cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para esto es necesario que la temperatura descienda (generalmente, a 55 ºC, aunque se puede variar según sea el caso entre 45ºC y 65ºC). Estos cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada.

3. Extensión de la cadena
Por último actúa la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. Se aumenta la temperatura hasta 72 ºC (para la Taq Polimerasa), temperatura a la cual la ADN polimerasa presenta su máximo de actividad, aumentando geométricamente la cantidad de fragmentos de ADN amplificados en la reacción.
Una vez completados todos los ciclos, se finaliza con dos pasos, uno de extensión de la cadena a la temperatura óptima de la ADN polimerasa, normalmente 72ºC, para finalizar enfriando la muestra a 4ºC para su conservación.
Este ciclo (desnaturalización-hibridación-extensión) se repetirá un número de veces dependiente de la cantidad de fragmentos amplificados que se desee. Generalmente son 30 ciclos, ya que un número mucho mayor de ciclos no implica un mayor rendimiento.

PCR anidada
Técnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificación es utilizado como molde para realizar una segunda amplificación con cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada. Este tipo de PCR es muy específica. (http://es.wikipedia.org).

PCR in situ
PCR realizada sobre preparaciones fijas sobre un portaobjetos. El PCR in situ consiste en una reacción de PCR en secciones histológicas o células, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación. Es realizada sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. En la técnica de in PCR-in situ se realiza primero amplificación de ADN blanco y luego detección mediante hibridación in situ convencional con sondas ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades pequeñísimas de genoma viral. Esta tecnología es de gran alcance en la capacidad de amplificar específicamente una población de menor importancia de secuencias. (http://es.wikipedia.org).

PCR multiplex
PCR en la cual se amplifica más de una secuencia en una misma reacción.
(http://es.wikipedia.org).

RT-PCR
Donde el molde inicial es ARN y se requiere de una transcriptasa inversa, como Tth, para realizar la conversión del ARN a un tipo de ADN llamado ADNc (ADN complementario). (http://es.wikipedia.org).

LA EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA

La embriogénesis somática (asexual o adventicia, consiste en el desarrollo de embriones a partir de células que no son el producto de una fusión gamética, o en otras palabras, es un proceso por el cual se produce una estructura bipolar (embrión) a partir de una célula somática (Encina & Perán ____)

Se pueden obtener embriones somáticos de muy diversas partes de la planta, así podemos utilizar como explantos: ápices radiculares y caulinares, hipocótilos, peciolos, pedúnculos, hojas jovenes y en general tejidos y órganos con características embrionarias, meristemáticas o reproductivas (embriones e inflorescencias inmaduras, trozos de escutelo, nucela y endospermo, óvulos, tejido ovárico). (Encina & Perán ____).

El callo es esencialmente un tejido parenquimatoso capaz de proliferación más o menos indefinida cuando las porciones son subcultivadas a intervalos, en un medio nuevo bajo condiciones asépticas. Esta capacidad proliferativa de tejidos vegetales en " cultivo fue mostrada en los trabajos de Gautheret (1939) y No-»-becourt (1939) con explantes de raíces de zanahoria y por White con segmentos de tallo de un híbrido tumoral de tabaco (Montoya 1991).

Embrionia adventicia

Una forma apomomixis es el mismo fenómeno por el cual se produce un embrión si fecundación.

Apogamian: es la producción de un embrión sin fecndación, a partir de cualquiera de la células del saco embrionario., distinta de la ovocélula.

Embrión somático

Son estructuras bipolares con un eje radical y un apical y no poseen conexión vascular con el tejido materno. Son capaces de crecer y producir plantas normales.

Ventajas

Naturaleza bipolar del embrión
Facilidad para su automatización
Aumento de coeficientes de multiplicación
Se comporta con los principios de la cinética microbiana
Permite el encapsulamiento de estas estructuras

Desventajas

Desconocimiento sobre parámetro que regula el proceso
Número limitado de especies que portan un sistema eficiente de embriogénesis somáticas.

Existen dos tipos de embriogénesis somática

El desarrollo de embriogénesis directa es cuando el embrión somático se origina directamente del explante sin pasar por callo.

La embriogénesis indirecta es el caso más frecuente y los embriones se-desarrollan a partir de tejido de callo; después de un período más o menos largo de proliferación a partir de células embriogénicas, las cuales se distinguen dé las otras células del callo por su aspecto similar a células meristemáticas: son pequeñas, isidrométricas, poco vacuoladas, ricas en, citoplasma, con núcleos prominentes y paredes delgadas (Montoya 1991).

Factores que afectan la embriogénesis somática

Genotipo de la planta
Tipo y estado fisiológico del explante
Reguladores de crecimiento
Condiciones del cultivo

Etapas de la embriogénesis somática

Formación de callo
Diferenciación de embriones (globulares, corazonado y torpedo)
Para generación de los embriones se debe cambiar el medio
Elongación de plantulas
Aclimatación

Variación samaclonal

Pueden generar mutaciones no deseadas
Factores que influyen en la tasa somaclonal
Genotipo de la planta y otros componentes del medio

ANEXO
PPM (Plant Preservative Mixture) es un detergente que controlar la contaminación de los explantes.
PPM es la solución definitiva de la lucha actual contra microbios en suspensión en el aire, el agua y la contaminación endógena

Trips (Thrips spp.). Trip o Piojillos de las cebollas, Trips del naranjo, del rosal Son pequeños insectos de 1-2 milímetros, como tijeretas en miniatura. Se ven a simple vista. Golpea sobre la palma de la mano una flor y caerán unos cuantos de estos bichitos. Hay varias especies distintas de Trips (por ejemplo, Frankliniella occidentalis).
• Producen daños sobre multitud de plantas de jardín y de interior, hortalizas, frutales, cereales, olivo (Trip del olivo), cítricos, etc., aunque en general, no son graves.
• No suelen ser importante en árboles, pero a veces es necesario tratar.

Microorganismos que son transportados por otros organismos son:
Las bacterias y los hongos.

BIBLIOGRAFÍA

____________LA MICROPROPAGACIÓN COMO HERRAMIENTA PARA LA PRODUCCIÓN VEGETAL http://www.sica.gov.ec/agronegocios/productos%20para%20invertir/fibras/microprop.htm



http://www.unizar.es/departamentos/bioquimica_biologia/docencia/FMBvirtual/Micropropa/Micvegetal.htm

Encina C. L. & R. Perán. _____ Embriogénesis somática http://www.encuentros.uma.es/encuentros39/embriogenesis.html

http://es.wikipedia.org/wiki/Reacci%C3%B3n_en_cadena_de_la_polimerasa

Montoya, H. L. M. 1991. Cultivo de tejidos vegetales. Universidad Nacional de Colombia.